·[操作]
·［注定事项］
·[试剂和器材]
[原理]
dna限制性内切酶消化是基因分析中的关键步骤。内切酶是最关键的工具酶。限制性内切酶是一类具有严格识别位点，并在识别位点内或附近切割双链dna的脱氧核糖核酸酶。
酶单位规定为：在最适反应条件下1小时完全消化lμgλdna的酶量为1个单位。需注意酶单位数是以切割线性dna为标准定出的。消化其它种dna则应根据dna分子大小、形状适当增加或减少所需的酶量，影响限制性内切酶活性的因素包括dna的纯度、缓冲液、温度及酶本身。不同的限制性内切酶对缓冲液中盐浓度的要求各不相同。一般配制高、中、低盐3种缓冲液，用于酶反应。dna甲基化，附有蛋白质或高分子量dna胶体溶液太粘稠均会降低内切酶的消化效率。由于在限制性内切酶消化反应中，甘油浓度超过5％（v／v）会抑制内切酶活性，因此在20μl反应体系中，甘油浓度应少于lμl。用2种酶消化dna时，各种酶所需盐浓度相同，则消化可同时进行；若需要的盐浓度不相同，则必须先用低盐浓度的限制性内切酶消化完后，再调整到高盐缓冲系统，加入高盐浓度的限制性内切酶，继续消化。
一定的dna分子的核苷酸顺序是一定的，某种限制性内切酶作用于该dna的切点数一定，故所得的dna片段数和片段的大小也一定，通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酸胺凝胶电泳分离，以标准dna（λdna／hindⅢ或λdna／ecori）作对照，溴化乙锭染色后，测出各dna片段移动的位置和距离。以各标准dna片段的分子量对数为纵坐标，各标准dna片段的移动距离为横坐标，求出各样品dna片段的分子大小。
[操作]
l．样品dna的限制性内切酶消化
（1）取2μg样品dna溶液加入0.5ml的eppendorf管中，加2μl10×限制性内切酶缓冲液，6～10个u的相应限制性内切酶，加消毒双蒸水至总体积20μl，于37℃保温酶解2小时，按上述条件用适当的几种不同的内切酶进行单酶或双酶解。
（2）在65℃加热5分钟或用适量的0.5mol／ledtana2终止反应。
2．dna酶解片段的电泳分离
取dna酶解作品2μl加上样缓冲液10μl（含溴酚蓝指示剂和甘油），在0.8％琼脂糖（含0.5μg／ml溴化乙锭）凝胶进行水平电泳，电压＜5v／cm，时间2小时左右，用紫外灯观察分析。
［注定事项］
1．分子克隆是微量操作技术，dna样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。
2．要注意酶切时加样的次序，一般次序为水、缓冲液、dna各项试剂，最后才加酶液。取液时，tip头要从溶液表面吸取，以防止tip头沾去过多的液体与酶，待用的内切酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回-20℃冰箱，防止限制性内切酶的失活。
3．凡用在酶切反应中的一切塑料器皿（eppendorf管，tip头等），都要新的，最后用重蒸水清洗，湿热灭菌，置50℃温箱中烘干，使用前打开包装，用镊子夹取，不直接用手去拿，严防手上杂酶污染。
4．当样品在37℃与65℃保温时，要注意：
（l）防止因盖子未盖严密使水汽进入管内，使反应溶液体积大量增加，造成实验失败。
（2）防止由于标签脱落，分不清样品类型。
5．由于温差原因，往往在盖上有水汽，因此样品酶切完毕或中间取样电泳要离心2秒钟，以集中体积内溶液，否则会发现酶切后体积少了。
[试剂和器材]
1．试剂
（1）限制性内切酶：如ecori、hindⅢ、pstⅡ、bamh1等，-20℃贮存。
（2）样品dna：如λdna、pbr322等，-20℃贮存。
（3）限制性内切酶缓冲浪配制，见下表（用消毒双蒸水配制，贮存于-20。c）；
（4）10×tbe电泳缓冲液:0.89mol／ltris；0.89mol／l硼酸；0.02mol／ledtana2ph8.0，高温灭菌，贮存于4℃。
（5）6×上样缓冲液：0.25％溴酚蓝；40％蔗糖；用消毒双蒸水配制，贮存于4℃。
（6）溴化乙锭溶液：称取溴化乙锭5mg溶解于lml消毒双蒸水中，4℃避光保存。
（7）消毒双蒸水。
2.器材
恒温水温箱；电泳仪；水平电泳糟；50μl可调移液器；紫外灯（上海康华生化仪器制造厂）。