·［操作］
·[试剂与器材]
·2.器材
[原理]
dna是通过异羟基洋地黄毒苷（digoxigenin，dig）配基标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸（dutp）随机插入结合而被标记。dutp通过间臂连结类固醇半抗原异羟基洋地黄毒苷酸基，形成dig-dutp，杂交反应后，杂交的靶dna通过酶联免疫法与一个抗体复合物[抗异羟基洋地黄毒苷配基碱性磷酸酶复合物（dig）ap]结合，接着在5-溴-4氯-3-吲哚磷酸盐（x-磷酸盐）和硝基四氮唑蓝（nbt）存在下，由酶催化反应，在杂交部位形成蓝紫色带或颗粒。
［操作］
1．转移
通过打点吸渍、噬菌斑或sonthern印迹转移等方法，把被测的dna转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上。
2．标记探针
取微型离心管于冰上，依次加入：lμg新鲜变性的dna；2μl六聚核苷酸混合物；2μldntp标记用混合物；加无菌双蒸水至19μl；加lμldna聚合酶大片段。37℃保温1小时至20小时，加入2μledta（0.2mol／l），终止反应，加2μl4mol／llicl，75μl预冷的乙醇沉淀dna，-70℃30分钟或-20℃2小时、离心收集沉淀物，真空干燥后加50μlte溶解。
3．预杂交
膜放入袋内68℃预杂交1小时，每100cm2膜至少用20ml预杂交溶液。
4．杂交
每100cm2膜用2.5ml杂交液（杂交溶液用预杂交溶液中加新鲜变性的探针组成），68℃至少杂交6小时。
5．洗膜
室温下用50ml2×ssc，0.1％（w／v）sds洗膜，5分钟×2次，68℃用0.1×ssc，0.1％（w／v）sds洗膜，15分钟×2次，晾干。
6．检测
（1）膜在缓冲液中洗涤1分钟。
（2）缓冲液Ⅰ稀释抗体结合物至150mu／ml（l:5000），稀释后的抗体结合物在4℃只能稳定12小时。
（3）膜在20ml稀释的抗体结合物溶液中保温30分钟。
（4）用缓冲液Ⅰ洗膜15分钟×2次。
（5）在缓冲液Ⅱ中平衡2分钟。
（6）在黑暗条件下，膜与新鲜配制的显色溶液放塑料袋内密封或放入合适的盒子内，几分钟开始显色。
（7）用50ml缓冲液iv洗膜5分钟，终止反应。
（8）摄影记录结果。
[试剂与器材]
1．试剂
dna稀释缓冲液：tris.cl(10mmol/l)，edta(lmmol/l)ph8.0，内含鱼精dna50μg/ml。
10×六聚核苷酸反应混合物。
dntp标记用混合底物：lmmol/ldatp:1mmol／ldctp；lmmol/ldgtp；0.65mmol／ldttp；0.35mmol／ldigdutp，ph6.5（20℃）。
dna聚合酶i大片段（标记级）：2u／μl。
(dig)ap结合物：多克隆抗异羟基洋地黄毒苷配基fab片段，结合有碱性磷酸酶750u／ml。
nbt：浓度为75mg／ml，溶于70％（v／v）二甲基甲酰胺硝基四氮唑蓝盐溶液。
x-磷酸盐：50mg／ml，溶于二甲基甲酰胺的5-溴-4氯-3-吲哚磷酸盐。
封阻试剂：粉剂
0.2mol／ledta，ph8.0（20℃）
4mol／llicl
70％乙醇
10％（v／v）n-十二烷基肌氨酸钠盐.
10％sds
20×ssc
杂交溶液：5×ssc；0.l％（w/v）封阻试剂；0.02％（w／v）sds。缓冲液Ⅰ：100mmol／ltris-ci；150mmol／lnacl，ph7.5（20℃）。
缓冲液Ⅱ：0.5%（w／v）封阻试剂溶于缓冲液中，封阻试剂不会快速溶解，因此应提前1小时配制此溶液，将试剂溶于50～70℃，此溶液保持混浊。
缓冲液Ⅲ：100mmol／ltriscl；100mmol／lnacl；50mmol／lnacl；50mmol／lmgcl2，ph9.5(20℃)。
缓冲液iv：10mmol／ltriscl；1mmol/ledta，ph8.0(20℃)。
显色溶液（新鲜配制）：10ml缓冲液Ⅲ中，加45μlnbt溶液和35μlx-磷酸盐溶液。
2.器材
常规实验室仪器设备。