基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。实际上是一套组合分子生物学技术,包括基因重组、细胞分离培养、转基因技术等。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。 “基因敲除细胞”的构建过程如下：

第一步：从小鼠囊胚中分离出胚胎干细胞（ES），在培养基中扩增。这些细胞中需要改造的基因称为“靶基因”。

第二步：构建基因表达载体。取与靶基因序列同源的目的基因（同源臂），在同源臂上接入新霉素抵抗基因等。由于同源臂与靶基因的DNA正好配对，所以能像“准星”一样， 将表达载体准确地带到靶基因的位置。

第三步：将表达载体导入胚胎干细胞，并与其内靶基因同源重组，完成胚胎干细胞的基因改造。

第四步：基因改造后的胚胎干细胞增殖、筛选。

基本原理如下图所示。

请根据上述资料，回答下列问题：

（1）“从小鼠囊胚中分离出胚胎干细胞（ES），在培养基中扩增”需要利用_______________酶处理使其成为_______________，再进行细胞培养；进行培养时，培养液中除葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素外，还要加入_______________。 “基因敲除技术”以胚胎干细胞作为受体细胞是因为胚胎干细胞具有 性。

（2）在把与靶基因序列同源的目的基因导入受体细胞前，应首先完成 ，在这

过程中所需要的工具酶是 。

（3）基因改造后的胚胎干细胞需要筛选，是一项的非常重要工作，原因是 。

（4）“基因基因敲除技术” 应用到DNA同源重组原理涉及的变异类型实际上是 。

（5）如果通过上图表示的过程，获得一枚“敲除”一个靶基因的胚胎干细胞，并培养成一只克隆小鼠，获得的小鼠，通过有性生殖产生的后代是否都含该目的基因？为什么?

， 。

（6）上述资料中新霉素抵抗基因的作用最可能是 。

（7）科学家利用“基因敲除”技术进行研究时，对照组是_______________。由于实验动物的基因组中_______________，所以通过实验动物与正常动物性状的比较，能够发现实验动物的_______________，从而确定被敲除基因的功能。

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（1）胰蛋白酶　 单个细胞　 动物血清 全能性

（2）重组DNA的构建 限制性核酸内切酶和DNA连接酶

（3）目的基因导入胚胎干细胞的成功率极低

（4）基因重组 （5）否 在形成生殖细胞时等位基因（目的基因和靶基因）会发生分离

（6）作为标记基因，便于筛选 （7）正常动物　　 被转入了目的基因（或突变基因） 性状变化（性状改变）

解析:

基因敲除技术实际属于基因工程技术，路线如下：（1）构建重组基因载体﹔（2）用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞（基因敲除的靶细胞目前最常用的是小鼠ES细胞）核内﹔（3）用选择培养基筛选已击中的细胞﹔（4）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。基因敲除的应用领域主要有：建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料；改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能，研究发育生物学；治疗遗传病；改造生物、培育新的生物品种。

【点评】此题根据“源于教材，高于教材”的命题思想，变式考查基因工程操作和运用。基因敲除技术可能是遗传工程中的另一重大飞跃。这项新技术在基础理论研究及实际应用中都将有着广阔的应用前景。遗传工程连续几年的高考热点