下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图甲、图乙中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：

（1）一个图甲所示的质粒分子经Sma Ⅰ切割前后，分别含有　 　　 个游离的磷酸基团。

（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越　 　　 。

（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Srna Ⅰ切割，原因是　 　　 。

（4）与只使用EcoR I相比较，使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止　 　　　。

（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入　 　　　酶。

（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了　 　　。

（7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在　 　　　 的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。

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（1）0、2

（2）高

（3）SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因

（4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化

（5）DNA连接

（6）鉴别和筛选含有目的基因的细胞

（7）蔗糖为唯一含碳营养物质

本题考查基因工程的限制性内切酶的作用特点

（1） 质粒切割前是双链环状DNA分子，所有磷酸基团参与形成磷酸二酯键，故不含游离的磷酸基团。从图1可以看出，质粒上只含有一个SmaⅠ的切点，因此被改酶切割后，质粒变为线性双链DNA分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有两个游离的磷酸基团。

（2） 由题目可知，SmaⅠ识别的DNA序列只有G和C，而G和C之间可以形成三个氢键，A和T之间可以形成二个氢键，所以SmaⅠ酶切位点越多，热稳定性就越高

（3） 质粒抗生素抗性基因为标记基因，由图2可知，标记基因和外源DNA目的基因中均含有SmaⅠ酶切位点，都可以被SmaⅠ破坏，故不能使用该酶剪切含有目的基因的DNA

（4） 只使用EcoR I，则质粒和目的基因两端的粘性末端相同，用连接酶连接时，会产生

质粒和目的基因自身连接物，而利用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ剪切时，质粒和目的基因两端的粘性末端不同，用DNA连接酶连接时，不会产生自身连接产物。

（5）质粒和目的基因连接后获得重组质粒，该过程需要连接酶作用，故混合后加入DNA连接酶。

（6）质粒上的抗性基因为标记基因，用于鉴别和筛选含有重组质粒的受体细胞。

（7）将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体后，含有重组质粒的个体才能吸收蔗糖，因此可利用蔗糖作为唯一碳源的培养基进行培养受体细胞，含有重组质粒的细胞才能存活，不含有重组质粒的因不能获得碳源而死亡，从而达到筛选目的。