9.（15 分）花椰菜易受黑腐病菌的危害而患黑腐病，野生黑芥具有黑腐病的抗性基因。用一定剂量的紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，并丧失再生能力。再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，以获得抗黑腐病杂种植株。流程如下图。

据图回答下列问题：

（1）过程①所需的酶是 。

（2）过程②后，在显微镜下观察融合的活细胞中有供体的 存在，这一特征可作为初步筛选杂种细胞的标志。

（3）原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压，其作用是 。原生质体经过 再生，进而分裂和脱分化形成愈伤组织。

（4）若分析再生植株的染色体变异类型，应剪取再生植株和 植株的根尖，通过 、 、染色和制片等过程制成装片，然后在显微镜下观察比较染色体的形态和数目。

（5）采用特异性引物对花椰菜和黑芥基因组DNA 进行PCR 扩增，得到两亲本的差异性条带，可用于杂种植株的鉴定。下图是用该引物对双亲及再生植株1—4 进行PCR 扩增的结果。据图判断，再生植株1—4 中一定是杂种植株的有 。

（6）对杂种植株进行 接种实验，可筛选出具有高抗性的杂种植株。

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【答案】（1）纤维素酶和果胶酶

（2）叶绿体

（3）保持原生质体完整性细胞壁

（4）双亲（或花椰菜和黑芥） 解离漂洗

（5）1、2、4 （6）黑腐病菌

【解析】

（1）过程①表示原生质体的制备，要用纤维素酶和果胶酶去掉植物细胞的细胞壁

（2）用于融合的两个细胞，一个是黑芥苗的叶肉细胞，一个是花椰菜的根部细胞，其中供体细胞特有的结构是叶绿体，可通过观察叶绿体的有无作为初步筛选杂种细胞的标志。

（3）原生质体没有细胞壁的保护，需要加入适宜浓度的甘露醇以保证渗透压的稳定，以避免原生质体吸水或失水破坏原生质体的完整性；原生质体通过细胞壁杂声形成杂种细胞，进而形成愈伤组织。

（4）分析再生植株染色体变异类型，需要将再生植株细胞染色体和黑芥苗与花椰菜细胞中的染色体制片观察进行比较，制片的基本程序是解离、漂洗、染色、制片。

（5）根据图谱，花椰菜含有碱基对为300 和600 的DNA 片段，黑芥还有碱基对为1000、1300 和1500 的片段，再生植株3,只含有长度为300 和600 的片段，与花椰菜一致，1、2、4 既含有花椰菜DNA 片段，又含有黑芥DNA 片段，为杂种植株。

（6）对杂种植株接种黑腐病菌，能正常生长的即为具有高抗性的杂种植株。