40．【生物—选修3：现代生物科技专题】（15分）

使用DNA重组技术，把天然或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，经纯化后而制得的疫苗称为基因工程疫苗。已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒，该病毒表面A蛋白为主要抗原，其基因工程疫苗生产流程如图30。请回答：

（1）过程①表示 。

（2）可能利用 技术扩增获得A基因。使用该技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列来合成 。还需要有耐热的 酶。扩增时DNA解链的温度应控制在 ℃。而互补链延伸时的温度应控制在 ℃。

（3）过程③构建A基因重组载体时，除了A基因外，还必须有 、 和 基因等。这一过程需要使用 和 这两种工具酶。

（4）过程④中选用大肠杆菌作为受体细胞，最常见的转化方法是：用 处理，得到 细胞，再将经过处理的细胞与溶有A基因重组表达载体的缓冲溶液混合，并控制在一定的温度使之完成转化。

（5）可用 技术检测受体细胞菌的DNA上是否插入了A基因，要检测A基因是否成功表达还需检测受体细菌 。

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【答案】

【解析】（1）过程①是以RNA为模板合成DNA是逆转录。

（2）大量获得基因的技术是PCR技术，PCR扩增DNA需要引物，还需要DNA聚合酶。扩增时没有解旋酶，用DNA热变性代替解旋，所以解旋的温度控制在90～95摄氏度，延伸时碱基要互补配对，温度要低，是70～75摄氏度。

（3）过程③构建A基因重组载体时，除了A基因外，还必须有启动子、终止子和标记基因等。这一过程需要进行切割和连接DNA，需要使用限制性核酸内切酶和DNA连接酶这两种工具酶。

（4）过程④中选用大肠杆菌作为受体细胞，最常见的转化方法是：用钙离子处理，得到感受态细胞，再将经过处理的细胞与溶有A基因重组表达载体的缓冲溶液混合，并控制在一定的温度使之完成转化。

（5）检测时可以用DNA杂交技术看看是否互补配对。还需要检测目的基因是否表达，检测是否合成A蛋白。