A.在五个区域中划线前后都要对接种环和培养基进行灭菌B.划线操作时打开皿盖，划完立即盖上C.接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的。D.第1区和第5区的划线最终要相连接起来，以便比较前后的菌落数在线课程C
试题分析：在每次划线前后都要对接种环进行灭菌；进行划线操作时，左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖；注意接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的；第1区和第5区的划线不能相连。故选C
考点：本题考查微生物平板划线的相关知识。
点评：本题意在考查考生的识记能力，属于容易题。