A.目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割B.目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割C.质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割D.质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割在线课程D
试题分析：限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC— ，限制酶II的识别序列和切点是—↓GATC—，可知限制酶II能够识别和切割限制酶II切割后的黏性末端。据题图可知，目的基因两端分别是限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC— 和限制酶II的识别序列和切点是—↓GATC—，只有用限制酶II才能将目的基因切割下来。质粒有GeneI 和GeneⅡ表示两种标记基因， 分别有限制酶II的识别序列和限制酶I的识别序列；如果用限制酶II切割，则GeneI 和GeneⅡ都被破坏，造成重组质粒无标记基因，不行；用限制酶I切割，则破坏GeneⅡ，保留GeneI，其黏性末端和切割目的基因所在DNA的黏性末端相同，可以连接，故选D。
考点：本题考查基因工程限制酶相关知识，意在考查考生能运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确的结论的能力。